老鱼实验室日志(更新到5-7日)-停止更新，由于深入课题的研究-需要保密

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d.rain

老鱼

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1^# 大中小发表于 2008-1-31 19:41 只看该作者

老鱼实验室日志(更新到5-7日)-停止更新，由于深入课题的研究-需要保密

想学习细胞培养的同学，请点击“手把手教你如何细胞培养”。关于发现但并不一定确定是“黑胶虫”，请点击老鱼在培养细胞中发现了“黑胶虫”吗？
2007-12-5! q2 s9 s7 Q  r* p3 p
1.3 j6 i. P2 c( E$ M. X
跟生化老师带学生实验，SDS-PAGE鉴定血清中r-球蛋白。
备注：
1.
进入实验室后一定要保护好自己。已经阅读有关毒性物质及其中毒后表现和如何处理。1 k7 s8 s# d7 G/ A; j$ K
2.6 U  k6 I5 j6 G, U) A, _% ]
把握住每一次可以动手操作的机会。7 b& k1 l; P8 e- l9 i9 f0 u2 w" @. `
3.5 z. K, p' z6 B: P6 l$ W" S/ u
实验前熟读实验原理及相关操作。
4.$ \; ?- P9 [$ \9 n& F# K
对于实验中液体的量取一定要认真仔细。8 A4 o* W+ O! E8 }! Z, p

2008-1-29
1.
取出小鼠眼睛取血；
2., a" a( g0 q( _  _
使用分析天平测量小鼠肿瘤与胸腺的质量；
3.
使用超净台完成一次针头式加压塑料小滤器；2 p$ c# D, n8 w# i( ^! J5 k
4.
听一次开题报告关于“疮疡治疗”。6 }/ w% W+ J  L" R2 q% Q/ k, h
备注：
1.0 D- e. }& B  B7 S
分析天平的使用我觉得不是很容易，也是比较容易出错的地方，出现“g”的时候是稳定的时候。
2.
超净工作台。一定要明确哪些是有菌的，哪些是无菌的。类似于缝合时做事。取一个开着盖的试管要从底的地方拿，手不要再瓶口上方活动。
3.: X% f  i4 F- n! [
开题报告材料已取。' L4 i: {4 C- D5 a
5 g3 w, _  \7 @+ ^
2008-1-30
1.5 ~* T5 W  S: o' [6 \
做的药理方面的实验，关于“抗炎治疗”。! \: s, X: e; _; i
2.
学会给小鼠记号；学会抓小鼠；学会给小鼠上药；学会处死小鼠；学会去除小鼠身上的药。" @7 p- m# p% {5 X, j% X$ S/ W7 _
备注：0 I3 u' r1 k( I" x( |: g
1.
标记：左上肢是1号，左下肢是2号，依次34，头上为5，头上加左上肢为6，依次往下。/ O1 j2 L6 d$ l! ^6 K4 V0 G5 S
2.
做实验前一定要把需要的表格做好。
$ o" M' e; b$ ^
2008-1-317 t, z% c1 I, P$ b0 K/ O: t
1.
使用相差显微镜对巨噬细胞计数-学会细胞计数法。
2.' D' F7 u  |; A5 \- [
使用相差显微镜观察人类白血病患者T细胞。2 B8 @4 Y" c: V  j7 k
3.' s- w8 m/ k4 c) n- T" Q% N9 N
学会使用高压蒸汽灭菌器对仪器消毒。- y& ?6 a9 H3 H. @5 a* v
4.
继续给小鼠编号，上药，处死，除药，剪掉耳朵，下肢，称量。9 T3 ]1 a% r$ e; n$ H5 e
5.* R+ P) ]/ Q8 p! z+ P: T% r7 R
学会使用离心机。: [! B( Q9 F. e4 Z% ~% b
6.
看师姐使用酶标仪-没学会。2 E  _# Q: \( G7 W. @$ }/ u. I
7.
熟悉细胞活力测定的MTT比色法。  }1 z; N4 p4 n% V4 T$ \. _. T
8.
知道冰冻保护剂-二甲基亚砜（DMSO）。$ Q, u# \9 q" M+ E' b: L# c/ [
备注：
1.
仔细阅读薛庆善《体外培养的原理与技术》。- N  P1 y/ |1 o3 f3 ]
2.
本来有机会跟师姐一起做RNA的逆转录，但帮另外一个老师做关于“抗炎治疗”的实验而没做成。
7 _4 v" p% a' V3 _
2008-2-1
1.
读《体外培养的原理与技术》9 c5 }  I% C% N
2.
使用相差显微镜观察巨噬细胞。7 Q8 @4 k: k0 Y$ l
3.
看师姐进行巨噬细胞的传代培养，以及对细胞内钙离子染色（不知是否是免疫荧光技术），并在激光共聚焦显微镜进行观察拍照，然后加入中药制剂观察胞内钙离子染色的变化。7 ^+ [8 e" z; m1 P( ^0 J" r
4.
使用培养箱。! _* z# W  u: W) |5 X6 h8 r" s8 O' _
备注：9 V# }6 B! ]! `, d- M4 E2 O! w
1.
悬浮细胞传代培养可直接进行，而贴壁生长的细胞需要经过胰酶处理。
2.
通入CO2的培养箱放入培养瓶后要将瓶口拧松使得CO2进入，控制培养基的PH值。拿出前要记得拧紧瓶盖。还有当打开培养箱门时不要说话，动作要迅速。6 }7 Q4 d2 ^4 B9 ?6 p6 z
3.
刚听师姐仔细给我讲了她的想法。她举了个例子，糖尿病足溃疡。起初溃疡面细胞发生炎症反应，而晚期久不愈合是因为细胞的过度炎症反应。炎症刺激细胞，产生大量巨噬细胞，巨噬细胞被活化后会变形，同时也会释放大量细胞因子。而巨噬细胞受到活化，向胞内传导信息时比较重要的第二信使是钙离子。所以利用荧光染色后观察胞内钙离子的变化。先用PMA处理Raw264.7（小树巨噬细胞Raw264.7经脂多糖诱导48h后分化为树突细胞）；然后荧光染色放到激光共聚焦显微镜下观察；然后加入中药制剂（Ber？忘了是什么了），再观察变化。给药浓度用MTT法算。有一点问题要提出来，巨噬细胞一方面可以吞噬外来异源物质发挥第一道防线作用，而另一方面如果巨噬细胞过多的话也会造成负面影响（具体是什么不知）。而现在不知道中药制剂到底是抑制还是激活巨噬细胞增值。我认为如果是激活，那就用在久不愈合溃疡的早期，若是抑制就用再晚期。---查阅文献看看PMA的作用，还有溃疡久不愈合是否因为过度验证造成的和巨噬细胞在炎症反应中发挥的作用。

2008-2-14
1.' z) Z4 C% Q8 S
阅读《体外培养的原理与技术》中“培养物的冷冻与复苏”，“培养物的污染“章节。8 Y  ~! q, H+ L6 N, }2 S
2.0 q% m/ L- s( m6 _) E! x
学会做细胞生长曲线。
3.
学会非玻璃化冻存T细胞的复苏方法。
备注：
1.
拒绝自己操作一次复苏（太不自信了，希望下次能够敢于动作操作）。2 p! Q. A+ Q& U# C
2.' o0 n! z7 k) T
从液氮中取出冻存小管要迅速转移到37-40摄氏度的水中，并且在1-2分钟中快速晃动使溶液完全溶解。DMSO在4摄氏度时读细胞毒性最小，因此在玻璃化冻存细胞的复苏要在4摄氏度冰浴中进行，而此处师姐快速加入培养液离心而未在4摄氏度冰浴中进行。6 v  h6 r0 b; d- u9 ?3 a

2008-2-15
1.
阅读师姐课题申请书“肿疡外用药芙蓉散提取物对炎症细胞释放炎性介质的调节研究”。
2.
看师姐做CD34免疫组化（pv-9000）中的几步。1 L# V% N& N+ J
3.; d& r5 Y( F" F- o
阅读“培养用液”，“CD34+细胞的MACS免疫磁性分离方法”，“单个核细胞的分离”。$ n6 ]4 R3 E3 Z9 P! {
备注：, s8 Z; R; W% ~* [8 K+ a. D
关于此课题申请书中的内容摘要。(涉及到实验室隐私问题,所以删去,只保留了部分参考文献)
(2)Burg ND, Pillinger MH.
1 O9 |/ I; c! |- E# ~+ w  M, q

The neutrophil: function and regulation in innate and humoral immunity.

Clin Immunol. 2001 Apr;99(1):7-17. Review.

" O( Y2 b/ J9 ~
(3)Bhatia M, Moochhala S.4 z1 b' m# j2 J# o. D; [; Z ]

Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome.

J Pathol. 2004 Feb;202(2):145-56. Review.

(4)Dannhardt G, Kiefer W.

Cyclooxygenase inhibitors--current status and future prospectsEur J Med Chem. 2001 Feb;36(2):109-26.

% @; K8 \8 g+ }; L8 I( ?
(5)李红霞、张进川、赵亚力，等。白细胞介素-10对急性肺损伤炎症/抗炎介质表达的影响(J)。中国危重病急救医学，2005，17（6）：338-341.  a/ Y/ S$ `6 s' q+ _6 M; B5 F& P
+ c* @  E0 ?% g7 L4 J# T6 s
1 \7 w% y! a. s/ J7 @" n& w4 d# R
2008-2-18  h7 D* n* J# x- w- s) y9 x+ \1 N
1.
阅读原代、传代培养，细胞复苏，单克隆抗体，细胞计数法。, W7 ^" v. X# ^& `  E( {
2.
看师姐复苏T细胞。3 M6 }' S% S+ \  e) S' o5 O) ^
3.
自己操作复苏RAW264.7巨噬细胞。
备注：
1.6 D  a' N/ p5 K
看与做是相差很大的两件事。9 _- J4 B! c4 |' p9 U; q
2.$ p. T. L2 @/ v* u: h
超净台上的工作需要注意很多事情，经常用酒精棉擦手、操作仪器用之前过外焰、瓶子不要过长时间开盖冲上摆放；注意整理好使用仪器的顺序，不要乱；如果有不对的操作使得瓶口或试管口等有被污染的可能，再过外焰，学会弥补；操作后收拾好东西，用前什么样，用后就什么样。具体的细节还是需要自己动作去做琢磨。

2008-2-201 u, ?$ b2 u% W+ n! b- v  z+ Z
1.  S  F' U8 L6 s0 R* t  r# y/ y
观察18号复苏的巨噬细胞。: ]4 J! h+ ^4 U9 Y* V7 @/ [
2.
再次复苏一盒RAW264.7巨噬细胞。  i" m, [- [$ T, i2 m  u6 E
3.5 l7 _! Q! T, B; m" r. n
再次阅读师姐课题申请书，及病理学“炎症”章节。
备注：
1.
18号复苏的巨噬细胞生长状态不是很好，有大量的细胞碎片，以及变形的细胞（梭形等）。经过考虑决定更换培养液继续培养。估计正常的巨噬细胞占20-30%。+ W2 T/ x8 b: ?) h+ q' {
2., `" j* M$ m% A7 [* s2 x- E
再次复苏一盒巨噬细胞。需要注意几点，在从液氮中或低温冰箱中取出冻存管一定要注意防止冻伤。在离心后加入培养液一定要充分将细胞吹打，否则会出现在镜下观察细胞成团。虽说在国内仪器用前要过火，但注意“度”，仪器有可能烧化后影响实验结果。  c3 ]7 ]% a; s; E0 i

2008-2-21
1.       再次观察18号复苏的巨噬细胞、停止培养。: k6 v* i9 ]! ]& P
2.       配置9：1（9份不不完全培养液，1份新生牛血清）。+ H! L/ H5 d; ?5 S5 h
3.       对20号复苏的巨噬细胞更换培养液。# m' O' y; I# G! T: |
备注：
1.       20号虽对RAW264.7 2008-2-18 P3更换培养液，但在镜下观察培养瓶中正常的巨噬细胞太少，所以决定放弃继续培养。0 }: t- \( o: u$ D/ p+ x* w! S
2.       新生牛血清与成年胎牛血清比起来蛋白质含量少。对于细胞培养营养要求不是太高的可以选择新生牛血清。操作时80ML的不完全培养液先加入10ML新生牛血清，再加10ML培养液。加液器使用时要在一挡吸入后吸管液面稳定后再取出。
3.       RAW264.7 2008-2-20 P4细胞经复苏后今天更换培养液镜下观察细胞生长良好。决定周一进行传代培养，所以要在周日进行更换培养液。传代培养的前一天以及复苏后的第二天需要更换培养液。/ d/ K# P% E4 d5 W& }' ^

2008-2-22( Q; k( Q: u! [. I# a7 }
1.       40倍镜下观察RAW264.7 2008-2-20 P4有霉菌，放弃培养。
备注：( {  t1 I0 y0 M. |, t* D  Y; x
1.       继复苏后再次出现问题，霉菌比巨噬细胞小很多，具体自己下图去看。决定明天重新复苏一盒RAW264.7。
2.       更换培养液的问题在于是否细胞需要更多营养。因为死亡的细胞会引起其他的细胞跟着凋亡。

2008-2-23
1.       再次复苏RAW264.7 2008-2-23 P3。
备注：$ Q4 z- ^  ?$ f: ^4 q
1.       第三次复苏不知是否能成功。挺丢人的觉得。事不过三。注意几个问题：学会统筹方法；复温培养液、超净台紫外、水锅；操作上还是有些不知道该怎么做，这是从书本上学不到的。
2.       复苏后观察有一些“杂质”，不知是什么，梭型的、比巨噬细胞大。& A4 l5 h. `3 F% e

2008-2-25: B; l1 T/ [0 p' S
1.
镜下观察RAW264.7 2008-2-23 P3，正常细胞约占20-30%，更换培养液继续培养。
2.
废玻璃化冻存T细胞。7 j$ n1 e9 V. l& ^/ v& F) ?, a! u( w
备注：
1.
RAW264.7 2008-2-23 P3如意料之中，生长状况并不十分理想。
2.
非玻璃化冻存参阅《体外培养的原理与技术》。大致步骤：移液到离心管-离心-配冻存液（血清：DMSO=9：1，冻存管1.8ml/支-取出离心管去上清液后加入冻存液，充分吹打-移入冻存管-密封放入4摄氏度、负20-30摄氏度、、、负80过夜、液氮。
3.* ]3 u4 S% @9 K* g4 {
RAW264.7 2008-2-23 P3杂质为酒精灯灯芯。6 O  ~5 a+ G0 C

2008-2-26
1.
镜下观察RAW264.7 2008-2-23 P3
备注
1.
生长状况良好，增值良好，但由于复苏操作有不对的地方使得初始正常细胞的数目太少（书上写应该达90%以上）。目前细胞数量约40%。分析好像上次复苏水浴冻存管加入离心管后未吹打直接离心，导致这此复苏仍不成功。虽然复苏步骤不复杂，可这3次复苏都因为不同的操作失误而没有成功。所以以后要认真，仔细注意细节。7 E" s8 x5 p( I; u) h0 W
* N; b' b1 S% T: E( I
2008-2-27
1.
镜下观察RAW2008-2-23 P3，并更换培养液。
备注：
1.
细胞生长状态良好，但成团叠层生长细胞较26号增多，担心空间过小引起接触抑制使得细胞凋亡。
2.
决定明天再复苏一盒RAW264.7。1 [2 {9 A+ V. J  i1 ]0 j  C4 N# ~

2008-2-28& `" l4 E# p. k  ~* p* I/ U
1.
学会琼脂糖凝胶电泳。+ P& x7 k' q; e4 v: i. S
2.
镜下观察RAW264.7 2008-2-23 P3，决定进行传代与冻存。
备注：' B# H9 t/ s  @# c
1.; X0 k" u' Z8 ~; ~3 Y6 ], V* ?- z
成纤维细胞取出总RNA，用oligo-gt（谁帮我指出这个，我不知道是什么，好像听的不对）处理，帅选出m-RNA，逆转录成DNA，然后PCR扩增，最后进行琼脂糖凝胶电泳。* y* a9 `  n( D5 Q4 x  k! K* X
2.0 x: W5 g$ j* X* C: r- ~: K
观察RAW264.7 2008-2-23 P3增值比前几天速度都要快。40倍下观察形态大多正常，决定传代一管，冻存一管。PS:手烧伤，大部分过程是师姐做的。

2008-3-2
更换RAW264.7 2008-2-28 P4培养液。
备注：
10倍镜下观察一个实业细胞约90%以上，周一进行下一步药物处理等。

2008-3-3
1.
配置完全培养液250ml（25ml成年牛血清+225ml不完全培养液）。/ B0 m% v& A6 y) J9 |3 [6 @
2.
对RAW264.7 2008-2-28 P4进行传代与冻存。
备注：. F% T* }8 |3 _7 ]& m
1.
配置完全培养液后再复温。, ^, A1 s* b  E  N+ ?, T
2.9 U; f1 J& V' Z
准备3个大离心管、3个试管、3个虹吸管、胰酶+EDTA、PBS、完全培养液（可以作为胰酶抑制剂）、先用PBS2ml洗两遍培养瓶，这时会损失一部分细胞。然后用胰酶2ml进行消化，摇匀可以加速消化过程，1分钟左右，放在镜下观察，细胞收缩、悬浮。立即加入完全培养液2ml，从一边到另一边，有步骤的吹打使贴壁细胞脱落。注意吸管不要划到培养瓶底面。接着转移到离心管后1500rpm离心5分钟，弃去上清液，加入2ml培养液，吹打完全后，分两瓶（这里细胞计数后定浓度或根据经验估计），每瓶0.5ml，再补足培养液5ml。镜下观察细胞仍然很多，各取出3ml悬浮液，又加入3ml培养液补足后放入37摄氏度，5%CO2培养箱。' z9 v& S( K/ S6 E$ ]8 t
3.+ Z0 C. `) w( e; g1 u9 w, v5 I' {
配置冻存液，按2ml每冻存管计算，9：1为血清：DMSO,另一离心管倾出上清液，加入冻存液，完全吹打后加入冻存管，封好，写好标签。由4摄氏度30min至-10到-20摄氏度间30min，然后至-30摄氏度30min，然后-80摄氏度，短期冻存可不必放入液氮中。一般冰箱上层4摄氏度左右，下层-20左右。
4.
胎牛血清fetal bovine serum
5.
新牛血清newborn bovine serum
6.9 x4 f) Q$ r# A6 T
成年牛血清adult bovine serum5 f! F' b* z, k7 y5 |  \5 Y1 B! g
7.- I+ O" U/ S6 ~6 L9 [: k: N
胎牛血清对许多细胞有促进生长作用，适用于细胞株的保藏及特殊娇贵的细胞株的体外培养。
8.( Q, e$ J2 O) [( ^+ L/ ?
新生牛血清多从出生后10天内的小牛获得，价格较胎牛血清便宜，适用于动物细胞原代和传代细胞培养。! U6 W$ r) F" k* }/ N& u8 Z
9.' q! V  g! t3 z; k: r" x
成年牛血清蛋白含量高，降低了培养的透明度，不利于细胞计数和形态学观察。: p( `5 u7 b1 v  C
10.0 W; \' J% U# w4 M( B# V3 Y9 J
DMEM（Dulbecco minimum essential medium）通过结合细胞质中的二价阳离子从而破坏细胞间连接。
11.
EDTA=乙二胺四乙酸二钠。
12.
HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）氢离子缓冲剂，长时间控制PH范围。  V- S) ~* [9 l: r
13.
根据细胞生长快慢、倍增时间长短决定接种细胞数量。倍增时间为24-48h，密度1*10的5次方个/m；,12-18h,密度为2*10的四次方个/ml。

+ l! r' [/ b! I  f1 o4 E. L

2008-3-6
对RAW264.7 2008-2-28 P4传代为RAW264.7 2008-3-6 P5。
备注：
1.; f6 o4 B$ d6 y7 p
镜下观察两培养瓶的巨噬细胞已经叠层生长。最后选择巨噬细胞激活较少的一瓶进行传代。
2.7 G$ ^5 R. O+ s
离心后倾出培养液，加入完全培养液5ml后计数。取出10ul用于计数，求得细胞浓度为8*105个/ml。所以要从悬液中分别取出800ul，一传二进行传代。2 a7 G& O! r1 S1 H, q

2008-3-9
更换RAW264.7 2008-3-6 P5培养液。
备注：
镜下观察细胞最底层细胞已开始老化，好像树叉一样从细胞四周散开。而最上层细胞是新生的、圆形、光亮的。

2008-3-106 O  P1 k5 h5 x9 W
1.
对RAW264.7 2008-2-7 P5一传二传代为RAW264.7 2008-3-10 P6，每瓶密度约为1*105个/ml.
2." a% D# f/ {' k* i' j, w; `. Q
计算并描绘RAW264.7 2008-3-10 P6的生长曲线。（96孔板，细胞密度为1*103个/ml,操作时间为2008-3-10 4:25pm）。
备注：
1.$ o! ?: a! A) E1 K' T
传代细胞需要进行细胞计数定密度，经摸索巨噬细胞传代密度可为1*105个/ml，但实际中仍可以根据生长状态等因素适当调整。
2.
选在96孔板操作，6*4（6列4行）滴入密度为1*104个/ml的细胞悬液（实际上是吸取10ul的原液，再加入90ul完全培养液，因为10的3次方没法用细胞计数板再计算）。由于时间限制，所以选择24h、48h、72h、96h后计数。
' D) Z/ I$ J2 |; s  {( o3 W
2008-3-11
1.6 [, _' b7 ]7 n: T& `* B
12：25pm向96孔板“24h”列加入10ul cell counting kit-8 500tests Lot WJ 727（cck-8）。0 I7 |) S' D, [0 V1 H; q4 m& B5 L
2.! A2 o4 w7 o1 e) j+ `% J
观察RAW264.7 2008-3-10 P6。+ B6 q% `! y/ A* \5 x2 B( M: j1 Q
3.- I+ l( o. u' j* n0 c8 C& ^: N
使用酶标仪测量“24h”孔的OD值，波长为450nm。
备注：
1.
96孔板中用的是6*4孔，每孔加入的细胞密度为103个/ml。但镜下观察每个孔里只有7-8个细胞，目前分析不出是什么原因，放入培养箱里继续培养。
2./ c$ H0 I' r& I; x3 U  N
MTT可以进入细胞，然后培养3-4h后，倾出液体加入DMSO，最后用酶标仪。而CCK-8的原理是？见下
3.9 j3 z8 V$ t1 e, E  N
镜下观察RAW264.7 2008-3-10 P6 ，发现许多“杂质”。师姐排除细菌污染，此“杂质”不是退化或凋亡的巨噬细胞。而是比正常巨噬细胞小，也是一圆形、黑色。中间散有白孔，无细胞结构。决定继续培养，明天再观察。8 ?  v3 {  D4 N8 S
Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

Ø WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。 ' F0 l( d5 a: h
' L1 E+ n  s, w) O" g" B
Ø WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。 " d0 r- Q* g$ g" V* l$ J7 O
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。+ u. g7 K: b$ |0 i  U8 K5 n
总之，CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。: s+ g# e, u0 T) H1 N# m
但是CCK-8比MTT的价格要贵不少，所以一般来说，还是MTT法用的多。
2008-3-12
: x% I  Q5 }8 x7 ~( j4 X3 m% n* S! J* V3 }
1.5 T. F7 @) l! [( K. r
观察RAW264.7 2008-3-10 P6以及96孔板中细胞。
2.$ U0 H! Z0 H+ a; A1 Y
对RAW264.7 2008-3-10 P6取上清液离心后涂片，镜下观察。( ?! E1 w# U. H- o' }
备注：
1.
RAW264.7 2008-3-10 P6镜下观察绝大部分细胞被激活，且昨天所见“杂质”在转动螺旋的情况下发现其周围有一圆形光晕，形状像具有膜结构。经涂片后进行革兰染色（步骤？），100倍油镜下观察因细胞碎片太多无法分清，所以未得到结果。
2.
96孔板中细胞生长不好，几乎看不到细胞，放弃继续培养及观察。
为了使染色方法更简便、快速，我们采用了革兰染色3步法，效果和四步法一样，现将革兰染色3步法与质量控制报告如下。

1 材料和方法. I4 _6 u4 J) a! f
( E/ B8 |% F/ J. t. P" i
1.1 材料* ?0 R) W' a% Q- o3 V& `
$ h2 j: m5 Q/ |5 [9 b
1.1.1 结晶紫染色液：(1)甲液：结晶紫2g，95%乙醇20ml。(2)乙液：草酸铵0.8g，蒸馏水80ml。甲乙2液先分别溶解，然后混合在一起，过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。  Y: |1 I9 V; c/ Z

1.1.2 碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100ml。先取少量蒸馏水加入碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加入全部蒸馏水，分装于滴瓶中备用。# b: t0 l6 K" Y& F
3 d6 w/ l6 |) f- G2 u( b9 y, G: G
1.1.3 复红酒精溶液：碱性复红0.4g，95%乙醇100ml(北京化工厂化学醇)。/ o8 p% \# }; G

1.2 革兰染色三步法的染色步骤：①在细菌涂片上加上结晶紫染色液，染1～2分钟，水洗，除尽水滴。②在涂片上加上碘液，平放1～2分钟，水洗，除尽水滴。③在涂片上加上复红酒精溶液，平放50～60秒，水洗，自干后用油镜作镜检。革兰阳性的细菌染成深紫色，革兰阴性细菌染成浅红色，色泽鲜明。
  q0 W4 K- A$ N  x3 f* a$ R9 d
1.3 质量控制：①取新培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别制成细菌悬液(标准菌株大肠杆菌，ATCC，25922；金黄色葡萄球菌，ATCC，25923)。②取洁净玻片数张，平放桌上，取一白金耳的大肠杆菌菌液放置于各玻片的左瑞，涂布成一个直径1～1.5cm的圆形细菌涂片，自干。③再用一小白金耳的金黄色葡萄球菌菌液放置于大肠杆菌涂片的中央，使成0.5cm左右的葡萄球菌菌液区，自干后在火焰上通过数次固定。存放玻片盒中备用。④实际工作时，取上列涂片一张，在大肠杆菌和葡萄球菌双重涂片的右侧，放上1滴或2滴(2处)生理盐水，取1种或2种被检菌，分别制成薄薄的涂片，自干，火焰固定后，与左侧质控菌双重涂片同时作革兰3步法染色。
3 k0 A: T! O: b# z5 i2 C4 b1 ^7 h
1.4 结果观察：先用油浸镜观察质控菌涂片的染色结果。正确染色结果，在涂片中央可见到染成浅红色的革兰阴性大肠杆菌和染成深紫色的革兰阳性的葡萄球菌，对比鲜明。若将镜头向外侧移动，可见到双重涂片和单层细菌涂片的交界区，在交界区的内侧可见到革兰阴性大肠杆菌和革兰阳性的葡萄球菌同时存在，而在交界区的外侧则只能见到单一的染成浅红色的革兰阴性大肠杆菌，界限分明，容易识别。
( j9 g6 P* Z, W: u. v( ^( u
只有在质控区见到正确的染色结果时，方可接着观察质控区右侧的被检细菌的染色结果。这样可以确保被检细菌染色结果的准确性。
5 s+ t" P9 j+ Z6 Y1 P9 P
2 讨论
7 ^1 |$ y9 o9 n0 B4 }
在设置有质控的情况下，我们应用这种革兰染色3步法试染过多种细菌，包括革兰阳性细菌，如表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、甲型乙型链球菌、肠道链球菌和革兰阴性细菌，如大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、肠道产气杆菌、伤寒杆菌和卡他双球菌等，均取得准确无误的染色结果，色泽鲜明，容易识别。细菌学染色方法的可靠性，很大程度上取决于染色方法本身的技术稳定性。本染色法中，结晶紫染色和碘液处理两步规定为1分钟，稍长时间也不致影响染色结果，而第三步即用复红酒精溶液退色和复染一步可能是关键性的，我们规定为50～60秒，经过上百次的染色试验证明是可靠的〔1〕。为了查明这步的可靠性，我们曾用3种细菌的涂片做了30秒、1分钟、2分钟、3分钟的不同时间的退色复染试验。结果表明，在3分钟以内的各次试验中结果一致良好。这一结果说明，本革兰染色3步法具有良好的技术稳定性，容易掌握，不易发生变动。染色结果的可靠性另一方面也决定于被检细菌的状态，新鲜培养的细菌能正确反映它本身应有的染色性，而老培养则常常可使一些革兰阳性菌变为革兰阴性菌，值得注意。

革兰染色4步染色效果很好，但操作比较复杂，现代实验室工作繁忙，对各项技术方法有力求简便的要求，以便在有限的时间内完成更多的任务。本文报道的革兰染色3步法，基本原理没有改变，只是把酒精退色和复染的两步合成1步中进行，这就可以达到减少操作，缩短时间，提高工作效率的目的。9 G/ j& U: ~+ W8 j8 g1 B* u

作者单位：赵舒斌(宁夏银川市临床检验中心 750001)
2 n, {/ M3 D3 V+ [
参考文献
9 m# c3 x! y$ K; B: Q3 C& I$ ]
1 黄元桐，等.革兰染色三步法与质量控制.微生物学报，1996.36(1)/ Z+ B9 Y" X. c
1 z7 P8 y' w% Y+ |2 L; `: i; |
(收稿：1998—05—25 修回：1998—08—11)责编：马兴忠
; ^* P) V' z9 I( T9 f
宁夏医学杂志
7 i4 l: `4 u  I$ E9 {. V! n
NINGXIA MEDICAL JOURNAL% L- G9 U  {1 R  F
0 r7 z' s7 S1 u- m# l
1999年第21卷第3期 Vol.21 No.3 1999
4 E$ u# U5 P+ c! q/ Z
0 p9 B& U5 U, W% P. Y
2008-3-242 @# U& _' }+ S. C) h; C; [" n
1.
配制完全DMEM250ml（245mlpure DMEM，5ml血清）。
2.+ C% L  G  _/ J; c/ i% n6 [0 V
复苏RAW264.7,名为RAW264.7 2008-3-24 P3。7 w8 X. X" P% b, {# G# |  h
备注：
1.
RPMI1640可成功培养白血病细胞。目前养的从白血病患者身体中提取的T细胞就用的这个培养液。
2.- _- Z3 [  l  Z3 @: ^/ f) L- x
可以从以下几个方面了解一个细胞系：潜伏期、繁殖能力、生长曲线、群体倍增时间、最高生长密度。3 P& Z9 E$ P9 `, s0 O$ a
3.
应该是血清占总培养液的10%，结果失误了，现在只占2%了。看看细胞生长情况再做打算。8 t! D+ U" u' s/ y! T
4.
复苏的巨噬细胞镜下观察要比前几次的都要好。圆形、光亮、基本无成团细胞。但在一个培养瓶中发现少许黑色杂志，怀疑是灯芯。这次离心用的是13ml的小离心管，感觉比大离心管在吹打细胞时好用: [! W- d! A! u# l* P$ q
4 O4 h% \- t5 ?
2008-3-25
1.4 A3 {. z0 ]4 r( i7 X8 `3 H
使用0.22um的针头加压式过滤器过滤233ml完全DMEM。; d4 j3 @3 K& U% k
2.
更换RAW264.7 2008-3-24 P3培养液。$ l3 E- o  A5 j$ t/ S# d
备注：4 U7 r6 ]) F' F. ^9 I( y; {' i
1.
10倍镜下观察细胞发现长势并不好，正常细胞较少，但不正常细胞不是被激活的模样。细胞碎片较多，背景又有些许黑点，好似被污染。肉眼观察完全DMEM发现有极细小丝状物较少。于是决定过滤培养液。完成后补充10ml血清及4ml双抗（青霉素链霉素）。最后更换培养液。
2.( t, x( ^8 {9 w8 s3 t
发现装有血清的离心管中有丝状物，与完全DMEM中发现的类似，师姐说血清中可有少量胶原蛋白。0 P/ |5 A# H6 y7 y

2008-3-27; x$ j7 l- x" n
! T+ N2 p1 V4 Z# |* v% @
1.
镜下观察RAW264.7 2008-3-24 P3，瓶底有许多“小黑点”，悬浮：转动细准焦螺旋发现有光圈，怀疑具有细胞结构，大小是巨噬细胞1/20左右,最后放弃培养.( _9 Y1 \0 i7 O7 x% _# r$ p0 s
2.5 y* o1 \8 I. j$ j% q0 r; ?
洗仪器.& R( u6 I% }" ]# o$ @5 y9 m( U" W
备注:
1.
3月3号配制的培养液仔细对光观察发现有丝状物,而RAW264.7 2008-3-1O P6也发现”小黑点”,于是将3月3号配制的完全DMEM取出一小瓶密封好放入培养箱培养,余下暂停使用.7天后观察取出的小瓶培养液未发现浑浊,颜色没有改变,排除细菌污染,因为若是细菌污染的话,培养液应该因细菌大量繁殖而变浑浊.6 ^( J( t: z, i4 g. e' P4 n$ w  F
2.
3月24号配制的完全DMEM发现有丝状物,而已经过0.22um针头加压式过滤器过滤,也应该可以排除细菌污染.6 N+ p$ X# t, j' Q* j- k* j
3.# W( _3 ?3 E; t3 i0 C# a
经师姐提示,查询有关”黑胶虫”信息.发现”黑胶虫”也是与我观察的小黑点一样,且单独培养血清或培养液也没有明显变化,可以通过0.22um的过滤膜,但目前关于”黑胶虫”的研究并不完全,所以暂时无法确定是否为感染”黑胶虫”,其可通过空气传播.
4.$ M! f$ s2 v% s
先用自来水泡一段时间,接着用微波振1个小时左右,接着用自来水重新10-20次,接着晾干或放入烤箱?(目前就做到这).: j% [- ~' o8 l. q

+ o  c& Z4 m2 n+ @) e" n& [% H7 p6 n4 @
2008-3-318 F: N- Y, `7 p6 Z9 m
复苏2007-10-27的巨噬细胞为RAW 264.7 2008-3-31 P33 X1 d& l  b( K0 T- @7 O# T
. X  N1 g5 w! z; i; S9 k9 n) X; p

2008-4-1, K$ f) u  f) S# `/ U2 d8 R; U1 f
更换RAW264.7 2008-3-24 P3培养液。
备注：% f+ Q" t: `# m0 Q$ ~9 u7 U9 p: o
1.
以前更换培养液没用过PBS先漂洗，这次用PBS冲洗一次后镜下观察比以前做过的要“干净”些。
2.
2号培养瓶10倍镜下细胞约占60%，1号约占70%。但两瓶细胞“树叉”样细胞较多，但估计很快会增值起来。3 W) E0 s+ ]8 s

2008-4-2; J2 e( q( E# q& Y
观察1、2号培养瓶。+ z9 ?' B  K/ V3 g. c0 i
备注：
1., g& i8 t" `# A. D( ^
1号比2号培养瓶中细胞生长状态好，1号10倍镜下一视野约占80%，2号约75%。
2.* H) j% Z0 E; x& m, N: A# F/ }
我认为20倍镜下观察细胞既能看出清楚的细胞形态，又不会像40倍镜下视野局限。
1 ?& }( X. H. B
2008-4-4/ F" K( d3 q; g  v1 R
1.8 e/ c! X& g# A; ]+ ^3 [# G% G  h
对1号培养细胞进行非玻璃化冻存，未计细胞浓度（理论上应在106-107间）。5 w3 m  k/ M$ H+ P) _0 h
2.1 O; A/ e0 ?* |; N4 J# Y
对2号培养瓶进行传代培养。一传三，密度为5*104/ml（太少，再08-4-5观察后）。
备注：" q0 @) q4 W* }8 o% y
1.
当要同时对两瓶细胞进行冻存和复苏，建议先后分开进行，理由在于消化完离心后倾出消化液后，一瓶细胞至少要在无培养液的情况下至少10分钟，这样对细胞损害大。不过也可以在消化完先冻存，而在要传代的离心管中加入计量的培养液。
2., l5 ^5 m+ E  ~8 D
讲一下在算完细胞密度后如何加减培养液调整细胞密度。拿这一次举例，离心倾出消化液后，加入2ml培养液，充分吹打后，取10ml放到细胞计数板上计数，两次计数平均细胞浓度为87*104／ml.若要调整到5*104/ml. 87除5约等于17倍,也就是说,取1ml细胞悬液要加入16ml培养液.考虑到培养瓶为25cm2规格.所以细胞液定为5ml.因此取细胞悬液为0.33ml.-----这是错误的方法,因为细胞密度要是在培养瓶中的细胞浓度,也就是说要后加入的培养液先计算到细胞密度里.因此,应该这么计数, 两次计数平均细胞浓度为87*104／ml,因此2ml里共有约等于180*104/ml个细胞,然后算多少个细胞除以5ml等于5*104/ml,也就是25*104个细胞,那么从180*104/ml里取出多少悬液细胞为25*104呢?对,答案是约等于0.6ml.所以取出0.6ml细胞悬液再加入4.4ml的培养液即可.5 C8 l6 j4 @1 i3 n& n. x, `
2 V! `6 z# X4 }# O& E! X
2008-4-7  B9 }; H& H; b9 J$ {; c
镜下观察1/2/3培养瓶,1号培养瓶细胞集中再瓶底最左侧(右侧为瓶口处), 20倍镜下一视野约占60%,其余各处分布不均匀.2号培养瓶细胞较第一瓶少,20倍镜下约占10%.3号培养瓶内几乎没有正常的细胞,全是细胞碎片,弃掉3号.其余培养瓶更换培养液后继续培养观察.-----由于上次传代时细胞密度计算错误,导致细胞数量甚少.! s  W3 f* P% [: K$ o4 F
, ~2 A: u  t: y% }; p
2008-4-8
对1号瓶细胞进行传代.
备注:
1.
镜下观察细胞叠层成团增长,但团与团之间相隔较远,在培养瓶左侧底部(靠近瓶口处为右),20倍镜下一视野细胞约70%,越向右越稀疏。决定进行传代，但经消化离心后，加入2ml培养液计数，发现细胞密度只有11*104、ml，也就是说若想满足5*104、ml，需要再加入2ml培养液，还是一传一，这样也好，细胞经吹打后均匀的散开培养瓶中。计算过程：11*104/ml,所以2ml里约有细胞20*104个,因此需加入4ml培养液才能使密度达到5*104.因此再加入2ml培养液即可.
2.( A" i1 X4 n0 m  p. A" e; H% w
2号瓶细胞20倍镜下一视野细胞不足10%,所以没进行任何处理,继续观察培养.
3 ?' e3 Z3 s" Z# q8 ^6 v
: g5 V, v2 i, q" ~
2008-4-9
镜下观察1、2号培养瓶。% u! Y8 T4 ]) v3 `+ k7 S# _$ I+ ^
备注：
1号培养瓶20倍镜下一视野约10-20%，排布均匀，分散。2号培养瓶镜下一视野约30%，不过局部成团叠层生长，但团与团距离较远。) I9 [0 |! n- G! _, n; D& I

2008-4-11
1.; j: W2 C1 J3 A2 N  _  L# u9 Q
对1号培养瓶RAW264.7 2008-4-8 P5更换培养液。" @) U! L* L# \/ x; k/ h4 [( o
2.2 D/ `1 c* C* Q. \( H2 y4 N7 a
对2号培养瓶RAW264.7 2008-4-4 P4传代为RAW264.7 2008-4-11 P5，并进行冻存。
备注：, T  `" P! x# L' u8 b! b" [
1.
2号培养瓶消化加入2ml培养液，充分吹打后细胞计数为125*104/ml,于打算按5*104/ml进行一传三.所以取250*104个细胞中的0.12ml=30*104个.最后去选细胞悬液0.12ml,培养液6ml.
2.2 O* W) T; }6 F  v* t2 m
将剩余的160*104个细胞再次离心后冻存5管,按1ml一管,5ml(4.5ml血清,1.5mlDMSO).$ C" m0 [4 L( R4 V9 a
有点乱，发个这几天的总结图片

1 U. Y4 p; g4 t
( B5 U5 j' A  L: u$ ?' M  e
1 k! V+ n9 g: b- x: w7 m+ @
1 ?: T! u5 e' ~# D

" X  Z& ^; @. K' c' H9 v! P, C
  l5 U" G3 e% V" }! y) ^

. y- e6 A4 A2 p6 H
2008-4-14
1.
镜下观察RAW264.7 2008-4-11 P5 1、2、4瓶，1、2号瓶细胞很少，3号基本没有正常细胞，更换1、2号培养瓶培养液，扔掉3号。
2.
对RAW264.7 2008-4-8 P5铺到96孔板，每空细胞密度为1*105/ml。" B; p; R; G8 n- f
具体步骤是：涉及保密。$ Q4 |$ b- _* w. K9 P
备注：- X8 _. ?0 k! M, \  R2 L+ n
96孔板中用6*12，但配细胞悬液时配了10ml，多余的悬液用于加入别的没用的孔，上述第三步以前。而第二步，左边的6*6没用药物刺激，只用了XXX，而右边用了XXX刺激4小时。第三步周围其他没用的孔用XXX补齐。0 ?: P$ P( R/ Z, C7 l* V% r0 Z

2008-4-16
1.
更换RAW264.7 2008-4-11 P5 1、2号培养液及 RAW264.7 2008-4-14 P6 1号培养液。  [# V* H! J& N0 q
2.7 A6 v$ g# s4 i# N" [  T6 j  x
对RAW264.7 2008-4-17 P6 2号进行1传三，密度为6*104/ml.
备注:
1.
4-11 P5 1、2号细胞碎片太多，怕影响生长，进行换液，但镜下观察细胞数量很少。
2.) |( t9 U, @/ `0 l7 [* R7 B3 h
4-14 P6 1号细胞均已贴壁。2号本认为数量会很多，但消化离心后发现只有6*105/ml.本打算对1号明天进行铺板,但密度小于1*106个细胞.8 t6 @) P% j6 x. t5 ^- {. R# Z5 X

2008-4-17
分别观察RAW264.7 2008-4-11 P5 12号及RAW264.7 2008-4-14 P6 1号和RAW264.7 2008-4-16 P7 12号.* ^7 @0 p& D9 J& U% ?6 p4 P
备注:7 N+ b' U: S* S; @1 B7 g
1.4 W* M6 u8 Z* w# j
4-11 P5的12细胞长势均不好. 4-14 P6 1号明天传代,周一应该可以铺板了. 4-16 P7细胞碎片很多,少数正常细胞均贴壁不牢,没做任何处理.
2.
这几天传代后的细胞在镜下观察,绝大部分细胞壁均不完整,且隔天后观察均死亡不少细胞,实在想不出是哪的问题.
5 B; q  v+ u! \, i$ `" }: |
2008-4-18
对RAW264.7 08-4-14 P6一传三。
: S2 t6 k7 X! X
2008-4-21
1.5 j( l3 b+ m& h" [1 G" q
观察RAW264.7 08-4-16 P7 1、2。
2.
冻存RAW264.7 08-4-11 P5 1、2.2 {; q' f0 k  P) t  M% q
3.
对RAW264.7 08-4-18 P7 1号进行铺板，密度为1*105/ml，冻存2号，更换3号培养液。
备注：
a)# }' x) ^4 I2 a3 a) v! D
P7 1、2号细胞开始局部成团长起来了，细胞状态“很好”，有少量细胞碎片，未换液，继续培养观察。! }) Y0 x# L/ F2 |) K
2.7 A9 ~1 F) D+ K+ E
4-11 P5 1、2号长势很好，但少量被激活（梭型），围绕在正常的细胞。未计细胞密度，将1、2号冻存3管。
3.% P% x2 k' z" I, R# U
将4-18 p7 1号消化传到96孔板上，密度为1*105/ml，余下2.1ml细胞悬液一传三，未计密度。2号冻存一管。3号细胞数量不是很多，换培养液继续观察，细胞状态“很好”。

2008-4-22
1.
4-18 P7 1号96孔板，9：40AM加入Fluo-Ca2+，每孔50ul，40min后倾出液体，用PBS洗每孔一遍，然后再加入100ulPBS检测（EX 488nm， EM503nm）。--其他步骤同4-14号。
2.8 H+ \4 `) A0 c' B
4-18 P7 2号冻存，5%DMSO。) P( }6 u1 P) P) Q, {! |
3.
4-16 P7 1、2号长势“很好”，状态“很好”，较少激活，培养液颜色浅红，估计养料够用，明天可以传代。
4.
4-21 P8 1、2号有少量正常细胞未贴壁，其余细胞生长状况“良好”，比以前传代后死亡大量细胞要好很多，这次传代目的就是检验自己操作长进没有。, N# N4 x5 z+ X7 A7 O  i) j7 j
备注：4 l& `0 [) K4 A2 m6 B4 @
1.8 A# F9 o7 J7 V: V
做荧光检测要用“黑孔”的培养板。
2.# \2 x) K$ \' V, }" X2 G- ^5 [( R
4-16 P7 1、2号6天未换液，因为1：细胞数量较少，且细胞碎片也很少。2：培养液颜色较红。但师姐说这么多天抗生素作用下降，所以至少3天换一次液。

2008-4-23
1.$ P- n  R$ r7 P" f$ [7 i3 S8 Q
更换RAW264.7 08-4-16 P7 1、2号培养液，每瓶约有30%被激活成梭型。
2.
共同收集RAW264.7 08-4-21 P8 1、2号消化后细胞，按照密度为1*105，重复MTT及Fluo-Ca2+铺板步骤检测，于8：30PM及8:40PM分别用药。

2008-4-24- v6 [% D8 l; v9 p$ h
1.
冻存RAW264.7 08-4-16 P7 1、2号3管。$ _$ c) Y1 O9 w4 t! S
2.; v$ K/ p! |. O5 o
11：45AM加入MTT，每孔20ul，3：45PM倒出MTT，加入DMSO50ul后，使用酶标仪检测OD值。
3./ g& v5 @, r; y9 r
2：45PM加入Fluo-Ca2+ 50ul，40min后加入PBS洗一遍每孔，然后加入PBS100ul使用连续光谱酶标仪检测。* v3 A: v& }1 x. i

  {# N" c- p6 ]" _; H+ o

2008-5-5
1.! a. K8 i- m- Y7 d* D2 [" A1 g
复苏08-3-3 P5传为2瓶为RAW264.6 2008-5-5 P5,A未计细胞密度。" I1 r; W$ P& y* C/ X, c
2.: [9 D% s  R) g/ Y, |" w) @; t' ~
配置50ulMTT，避光4°下保存（250mgMTT粉与50mlPBS）。
3.: A5 R. A/ `: t) U* k) Y
配置Pure DMEM 100ml（100ml三蒸水，一包DMEM粉末，3.7gNaOH，20mmol/l=4.66gHepes）.( g9 x! {$ C' \1 D+ a
备注:
1.: J/ S! i4 B, t9 c9 U& Q
这次复苏细胞感觉太好了,复苏后细胞形态圆形,细胞壁都很完整,光亮.但分了两瓶观察细胞有些多,按理说应该分3瓶.并且这次只加入2ml完全DMEM,打算4小时后再补足培养液.这样做的目的是尽快让细胞贴壁.0 J1 E$ @# |4 m7 @
2.
书上写用培养液,PBS或生理盐水一同配置MTT.但这里直接用PBS或生理盐水配置.5mg/ml的浓度,瓶子要避光,操作时用锡纸包裹瓶子,最后用0.22ul的枕头加压过滤器过滤保存.
  j; b! s- K1 D6 t( ]
2008-5-6
观察RAW 264.6 2008-5-5 P5 两瓶细胞,更换培养液.
备注:$ u" ~# D6 V/ L4 [' j# \' p4 I
这此复苏后感觉比以前的细胞要大.细胞碎片挺多,没按照昨天料想的情况增值很快,用PBS清洗一遍后换培养液.( I3 @4 ?- n" b6 ^
( ^8 v; e4 @( p0 m- b9 U6 G& h
08-5-71 X) ]+ u, f) l% m3 b. x$ e1 i
观察RAW 264.6 2008-5-5 P5 两瓶细胞.; M- \$ A7 f  b1 y/ g' i/ |- \
备注:
细胞较6号变化不大,数量也没有增多.2 H! K( p; P1 q
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